掃描電子顯微鏡樣品制備常用的兩種方法：化學(xué)方法和冷凍方法的介紹

化學(xué)方法制備樣品的程序通常是：清洗→化學(xué)固定→干燥→噴鍍金屬。

①清洗
 某些生物材料表面常附血液、細(xì)胞碎片、消化道內(nèi)的食物殘?jiān)⒓?xì)菌、淋巴液及粘液等異物，掩蓋著要觀察的部位，因而，需要在固定之前用生理鹽水或等滲緩沖液等把附著物清洗干凈。亦可用5%碳酸鈉沖洗或酶消化法去除這些異物。
②固定
通常采用醛類與四氧化鋨雙固定，也可用四氧化鋨單固定。四氧化鋨固定不僅可良好地保存組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)，而且能增加材料的導(dǎo)電性和二次電子產(chǎn)額，提高掃描電子顯微圖象的質(zhì)量。這對(duì)高分辨掃描電子顯微術(shù)是非常重要的。為增強(qiáng)這種效果，可用四氧化鋨-單寧酸或是四氧化鋨-珠叉二胼等反復(fù)處理材料，使其結(jié)合更多的重金屬鋨，這就是導(dǎo)電染色。 
③干燥
固定后通常采用臨界點(diǎn)干燥法。其原理是：適當(dāng)選擇溫度和壓力，使液體達(dá)到臨界狀態(tài)，從而避免在干燥過程中由水的表面張力所造成的樣品變形。對(duì)含水生物材料直接進(jìn)行臨界點(diǎn)干燥時(shí)，水的臨界溫度和壓力不能過高。通常用乙醇或丙酮等使材料脫水，再用一種中間介質(zhì)，如醋酸戊酯，置換脫水劑，然后在臨界點(diǎn)干燥器中用液體或固體二氧化碳、氟利昂13以及一氧化二氮等置換劑置換中間介質(zhì)，進(jìn)行臨界干燥。
④噴鍍金屬
將干燥的樣品用導(dǎo)電性好的粘合劑或其他粘合劑粘在金屬樣品臺(tái)上，然后放在真空蒸發(fā)器中噴鍍一層50～300埃厚的金屬膜，以提高樣品的導(dǎo)電性和二次電子產(chǎn)額，改善圖象質(zhì)量，并且防止樣品受熱和輻射損傷。如果采用離子濺射鍍膜機(jī)噴鍍金屬，可獲得均勻的細(xì)顆粒薄金屬鍍層，提高掃描電子圖象的質(zhì)量。

冷凍方法制備樣品
低溫掃描電子顯微術(shù)是20世紀(jì)80年代迅速發(fā)展和廣泛應(yīng)用的方法。它包括生物樣品的冷凍固定、冷凍干燥、冷凍割斷和冷凍含水樣品的掃描電子顯微術(shù)等。
①冷凍固定
將生物材料投入低溫的致冷劑中，如液氦、液氮、液體氟利昂及丙烷等。快速冷凍可使生物組織細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和化學(xué)組成接近于生活狀態(tài)。被冷凍固定的生物樣品，可以在低溫條件下轉(zhuǎn)移到具有低溫樣品臺(tái)的掃描電子顯微鏡中直接觀察無需進(jìn)一步處理或僅在冷凍樣品表面噴鍍一薄層金屬。這種方法不僅快速簡(jiǎn)便，而且可以排除由于干燥法造成收縮的假象，特別適合于研究含水量很高的生物材料。
②冷凍干燥
 生物樣品經(jīng)冷凍固定后，其中的水分凍結(jié)成冰，表面張力消失；再將冷凍樣品放于真空中，使冰漸漸升華為水蒸氣。這樣獲得的干燥樣品在一定程度上避免了表面張力造成的形態(tài)改變。由于水冷凍而形成的冰晶會(huì)破壞組織結(jié)構(gòu)，冰在真空中升華速度很慢，同時(shí)需要大型復(fù)雜的冷凍干燥裝置，所以冷凍干燥法沒有臨界干燥法應(yīng)用廣泛。如果在冷凍前用有機(jī)溶劑置換樣品中的水，而后，冷凍干燥，則可消除冰晶對(duì)結(jié)構(gòu)的破壞，并大大縮短干燥時(shí)間；也無需特殊裝置。
③冷凍割斷
為了觀察臟器或細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)，可切斷冷凍樣品，再經(jīng)化學(xué)固定、導(dǎo)電染色、脫水和臨界點(diǎn)干燥及噴鍍金屬，用掃描電鏡觀察割斷表面暴露出的內(nèi)部結(jié)構(gòu)。冷凍割斷又包括乙醇割斷法、二甲基亞砜割斷法及冷凍斷裂法等多種。用冷凍割斷法可獲得高分辨的組織細(xì)胞內(nèi)部三維構(gòu)造的掃描電子顯微鏡圖像。